Fundal
Melanotan I, cunoscut și sub numele de Afamelanotide, este o polipeptidă liniară compusă din 13 aminoacizi care este gata să joace un rol din ce în ce mai important în cercetarea farmaceutică. Numele engleze principale pentru Melanotan I sunt Melanotan-1 și Afamelanotide. Ca analog sintetic al hormonului de stimulare a α-melanocitelor α-MSH), Melanotan I poate fi utilizat pentru a trata tulburările de fotosensibilitate cauzate de protoporfiria eritropoietică. În prezent, majoritatea produselor Melanotan I sunt etichetate numai pentru cercetare și nu sunt încă destinate utilizării umane. În sinteza tradițională în fază solidă, alegerea rășinii are un impact semnificativ asupra eficienței de cuplare și a purității finale a produsului.
Informații de bază
Nume chinezesc: Melanotan 1
Nume englezesc: Melanotan-1
Nr. companie: GT-A006
Nr. CAS: 75921-69-6
Secvență: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
Formula moleculară: C78H111N21O19
Greutate moleculară: 1646,88
Metoda de preparare
eu. Prepararea rășinii Fmoc-Val-Amino
Pasul 1:Se cântăresc 11,11 g (5 mmol) de rășină Ramage Amide AM cu un grad de substituție de 0,45 mmol/g și se adaugă într-un reactor în fază solidă. Adăugați DCM pentru a umfla rășina timp de 30 de minute, apoi scurgeți. Spălați de trei ori cu DMF. Se adaugă o soluție de DMF care conține 20% piperidină (v/v) și se reacționează timp de 5 minute. Se adaugă încă o soluție de piperidină DMF 20% și reacționează timp de 10 minute, cu o spălare cu DMF între ele. După terminarea reacției, scurgeți și spălați de trei ori cu DMF.
Pasul 2:Se dizolvă 5,09 g de Fmoc-Val-OH, 2,02 g de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) și 2,32 ml de DIC (N,N'-diizopropilcarbodiimidă) în DMF la 0°C. După dizolvarea completă, se adaugă amestecul în coloana de reacție și se reacţionează la temperatura camerei timp de 1 oră. Monitorizați progresul reacției folosind testul ninhidrinei, asigurând un rezultat negativ. După ce reacția se încheie, se spală de trei ori cu DMF pentru a obține rășină Fmoc-Val-amino.
II. Prepararea peptidei de rășină complet protejată de Melanotan I.
Pasul 1:Se adaugă piperidină 20% în soluție de DMF (raport de volum) la Fmoc-Val-aminoresin de mai sus. Reacţionează timp de 5 minute, apoi se adaugă o altă porţie de piperidină 20% în soluţie de DMF şi reacţionează timp de 10 minute. Spălați o dată cu DMF în timpul intervalului. După ce reacția este completă, se usucă sub vid și se spală de trei ori cu DMF.
Pasul 2:Se dizolvă 5,06 g Fmoc-Pro-OH, 2,02 g HOBT (1-hidroxibenzotriazol) și 2,32 ml DIC (N,N'-diizopropilcarbodiimidă) în DMF la 0°C. După dizolvarea completă, se adaugă amestecul în coloana de reacție și se reacţionează la temperatura camerei timp de 1 oră. Monitorizați progresul reacției folosind testul cu ninhidrine (testul Kaiser) până când se obțin rezultate negative. După finalizare, se spală de trei ori cu DMF pentru a obține Fmoc-Pro-Val-aminoresin.
Pasul 3:Urmând metoda descrisă în Pasul 2, cuplați secvențial fiecare aminoacid conform secvenței Melanotan I. După terminarea reacției de cuplare Ac-Ser(tBu)-OH, se spală de trei ori cu DMF, de trei ori cu DCM (diclormetan) și de trei ori cu metanol. Se usucă sub vid pentru a obține 23,89 g de peptidă legată de rășină Melanotan I complet protejată.
III. Prepararea peptidei brute Melanotan I
23,89 g de peptidă legată de rășină Melanotan I complet protejată au fost plasate într-un balon cu fund rotund. La 0°C, s-au adăugat lent sub agitare 250 ml dintr-un cocktail de scindare pre-preparat (compus din TFA:tioanisol:fenol:triizopropilsilan:apă = 82,5:7,5:5:3:2 în volum). Amestecul a fost reacţionat la temperatură scăzută timp de 0,5 ore, urmată de reacţie la temperatura camerei timp de 2 ore. Soluţia de scindare a fost apoi filtrată sub vid. Această soluţie s-a adăugat lent la 2 I de eter dietilic anhidru rece cu gheaţă sub agitare. Peptida brută a fost izolată prin filtrare, spălată de trei ori cu dietil eter răcit cu gheaţa şi s-au obţinut 8,55 g de peptidă brută Melanotan I.
IV. Prepararea peptidei purificate Melanotan I
Pasul 1:Se dizolvă peptida brută Melanotan I în 100 ml de apă purificată și se filtrează printr-o membrană de 0,45 μm pentru a obține o soluție brută de peptidă.
Pasul 2:Se purifică peptida brută Melanotan I utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Utilizați o coloană de compresie axială dinamică DAC-HB50 cu faza mobilă A (soluție apoasă de acid trifluoracetic 0,05%) și faza mobilă B (acid trifluoracetic 0,05% în acetonitril). Efectuați eluția cu gradient pentru separare și purificare. Detectați proba folosind un detector UV și colectați soluția de peptidă corespunzătoare vârfului țintă în fracțiuni.
Pasul 3:După purificarea HPLC, se obțin 180 ml de soluție de trifluoracetat de Melanotan I cu o puritate care depășește 99%. Se concentrează soluția la 50 ml prin evaporare rotativă.
Pasul 4:Se echilibrează coloana de cromatografie cu apă deionizată și se încarcă 50 ml de soluție purificată de trifluoracetat Melanotan I (puritate >99%). Se eluează timp de 50 de minute într-un sistem de soluție apoasă de acid acetic 2%. Se concentrează produsul țintă colectat la 80 ml prin evaporare rotativă. Efectuați uscare înainte de congelare și uscare prin congelare pentru a obține în cele din urmă 5,33 g de peptidă purificată Melanotan I, cu un randament de 32,33%.
Ora postării: 2026-01-05